サービスについて

概要

PacBioシーケンスは、従来の手法と比べて、圧倒的に長いリードを獲得できる手法になります。
数十キロベースのロングリードのシーケンスにより、完全長ゲノム配列の作成、mRNAアイソフォームのリストアップ(Iso-Seq)、といった従来の手法では対応が難しかった場面で有効です。また、PCRを用いない、1分子レベルでリアルタイムに塩基を読み取るシーケンス法になりますので、増幅によるGCバイアスのリスクを排除できます。
本サービスでは、取得データ量、リード長・精度の異なる複数の仕様で対応が可能です。
目的やご要望に応じて、最適な仕様でご案内をします。

【1 Cell Run】
PacBio Revio(HiFi Read)    :60-90Gb程度/Cell
PacBio Sequel IIe(HiFi Read)  :20-30Gb程度/Cell
PacBio Sequel IIe(CLR Read) :100 Gb程度/Cell

【相乗りプラン】
PacBio Sequel IIe(HiFi Read, 100Mb):ゲノムサイズ 5Mb未満のバクテリア向け
PacBio Sequel IIe(HiFi Read, 200Mb):ゲノムサイズ10Mb未満のバクテリア向け

PacBio Reviofig.1)(fig.2)(fig.3)(fig.4
PacBio Revioは、ヒトHiFiゲノムを1年間に1300サンプル解析できる能力を有しており、PacBio Sequel IIeシステムと比較して 20 倍超の演算能力を持ちます。HiFi シーケンスでは、90% の塩基が≥ Q30、リード精度の中央値が≥ Q30 という優れた精度により信頼性の高い結果が得られます。

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【データ解析】
・de novo Assembly解析
・Annotation解析
* 解析に必要な取得データ量の目安:ゲノムサイズの20x以上

・Mapping, Variant call, Annotation解析
・SV、CNV解析
* 解析に必要な取得データ量の目安:ゲノムサイズの15x以上

PacBioシーケンスの特徴

ロングリード
数十キロベースのロングリードのシーケンスは、ゲノム全体を調べ、様々な構造変化を網羅的に把握することに長けています。また、完全長ゲノムを決定する際には、リードの短い従来法に比べ、コンティグの数を減らす(ギャップの数を減らす)ことができます。さらに、mRNAなどの転写産物の全長を 1 リード内に収めることも可能であるため、高い精度でアイソフォーム(スプライシングバリアント)を同定することも可能となります。

高い精度
ライブラリー調製の工程で PCR 増幅を行わないため、増幅時のエラーや GCバイアスの影響を受けることなく、また、シーケンスエラーもランダムに発生するため、非常に精度の高いコンセンサス配列を得ることが可能です。得られたロングリードのコンセンサス精度は 「99.999%」 を超えます。このため、de novo Assemblyやターゲットリシーケンスに非常に効果的です。

高精度ロングリード HiFiリード について
Circular Consensus Sequencing (CCS) を用いてHiFiリードを生成することで、取得データ量は制限を受けますが、より高精度なロングリードのデータを取得することが可能です。 高精度ロングリードである HiFi Read では、de novo Assembly に必要な取得データ量の目安が、ゲノムサイズの20x以上となります。

PacBioシーケンスが有効なアプリケーション例

完全長ゲノム配列の作成(全ゲノムシークエンシング)(fig.5
従来の次世代シーケンスで用いられる、数百塩基単位のショートリードをアセンブルして完全長ゲノムの構築を目指す方法では、多くのコンティグが作られ、たくさんのギャップ(隙間)ができていました。
それに対し、数十塩基の超ロングリードを獲得できるPacBioシーケンスでは、コンティグも少なく、ギャップが生まれにくいことから、完全長ゲノムDNAを目指す場合に非常に有効な手段となります。


リピート配列のシーケンス(fig.6
従来のショートリードを繋げる方法では、各リード同士が似た配列となるため、リピート領域の中の繋がり方や、リピートの数が判別しにくいため、埋まりきらない領域として残っていました。
それに対し、PacBioの超ロングリードであれば、リピート領域の入り口から出口までを1つのリードでカバーできるため、リピート領域全体を決定することが可能となります。

mRNAアイソフォームのリストアップ(Iso-Seq)(fig.7
ショートリードをアセンブルする従来の次世代シーケンサーを用いたRNA-Seqでは、アイソフォーム(スプライシングバリアント)の判別が困難でした。
れに対し、ロングリードのPacBioシーケンスでは、1つのリードで mRNA 分子全体を網羅することができる(mRNAの全長を 1リードでシーケンスできる)ため、多様なアイソフォームが混在する場合でも、それらを区別して、特性を評価することが可能です。

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