特長
- 国内の研究施設で実施
- タカラバイオ製pLVSINベクター、pLVproベクターを利用いただけます
- 安定発現細胞作製も承ります
概要
レンチウイルスベクター作製受託サービスでは、タカラバイオオリジナルの一過性ウイルスベクター産生システムを用いて、目的遺伝子を搭載した高力価のレンチウイルスベクターを作製いたします。
レンチウイルスベクターを用いた遺伝子導入法は、一般的に以下の利点を持ち、動物細胞への効果的な遺伝子導入法として、多くの遺伝子導入実験に利用されています。
- 初代培養細胞、幹細胞、神経細胞、非分裂細胞を含むほぼ全ての哺乳類細胞に遺伝子導入できる。
- 安定な遺伝子導入細胞株を得ることができる。
- ヒト、マウスおよびラットを含む多くの動物細胞に遺伝子導入できる。
- 動物個体に直接遺伝子導入できる。
＜pLVSINベクター＞（
fig.1）
3’LTR/ΔU3のSIN型ベクターであるため、P2実験施設で使用可能です。
mRNAを安定化するWPRE配列、ウイルスゲノムの核移行や宿主染色体への組換え効率を高めるcPPT配列などにより、高力価レンチウイルスの産生および導入遺伝子の発現レベルが向上したベクターです。
Packaging MixはTatタンパク質発現プラスミドを含む「Lentiviral High Titer Packaging Mix」を用います。
＜pLVproベクター＞（
fig.2）
pLVproベクターはpLVSINの5’LTRのU3領域をCMVプロモーターに置き換えたHIV-1 Tat非依存性の第三世代レンチウイルスベクターです（下図 ポイント①）。P2実験施設で使用可能です。
pLVSINからHIV-1由来の配列を極限まで排除し安全性を高め（下図 ポイント②、③）、高力価のレンチウイルスベクター調製のためにパッケージングシステムを最適化したベクターです。コンポーネントが減った分、搭載可能な目的遺伝子の長さが5 kb（推奨）まで増えました。
Packaging MixはTatタンパク質発現プラスミドを含まない「LVpro Packaging Mix」を用います。
サービス内容
レンチウイルスベクター作製（fig.3）
本受託サービスでは、レンチウイルスを産生するために必要なタンパク質を発現するプラスミドMix（Packaging Mix）と、レンチウイルスベクタープラスミドを宿主細胞に同時にトランスフェクションすることによって、一過性にレンチウイルスベクターを取得します。
エンベロープはヒトを含む広範な生物種に感染可能なVSV-Gを使用します。
トランスフェクション後の培養上清をフィルターろ過してレンチウイルスベクター液とし、小分け分注して納品いたします。
作製したウイルスベクター液の力価は、Lenti-X qRT-PCR Titration Kitで測定したRNAタイターを報告いたします。
＊ タカラバイオ取扱ベクター以外を使用する場合は、別途お問い合わせください。
＊ この段階でin vitroの実験にご使用いただくことができます。
＊ ウイルスベクターの力価は、測定方法により異なります。また、ウイルスベクター液の組成、測定に使用する細胞や血清などの影響により、同じ方法であっても施設によって異なることがあります。ご了承ください。
【オプションサービス】
プラスミドDNA調製
- 目的の遺伝子を挿入した発現プラスミドDNA作製
- 挿入遺伝子のサイズ、挿入遺伝子（接続部位を含む）の塩基配列を確認
＊ pLVSIN-CMV、pLVSIN-EF1α Vector、pLVproシリーズを使用します。
薬剤耐性コロニー検出法による力価測定
- 薬剤による選択後、薬剤耐性コロニーを検出し、感染力価を測定
＊ ネオマイシン耐性コロニー検出法の標的細胞には、ヒトHT1080細胞を使用いたします。ウイルス力価として得られる数値は、ウイルス液1 mlあたりのネオマイシン耐性コロニー形成能を示します（Neomycin colony forming unit/ml）。
レンチウイルスベクターによる遺伝子安定発現細胞株作製
- レンチウイルスベクターの作製
- 標的細胞のセットアップ、レンチウイルスベクターによる遺伝子導入
- 薬剤耐性となった目的遺伝子導入プール細胞の調製
- リアルタイムPCRによる目的遺伝子の発現確認
レンチウイルスベクターの大量調製（ご希望のスケール）
ウイルスベクターの簡易濃縮（約100倍まで）または超遠心分離による精製（VSV-Gシュードタイプウイルス）
＜作業仕様＞
－宿主細胞（293T）の培養
－プラスミドトランスフェクションによるレンチウイルス一過性発現
－ウイルスベクターを含む培養上清を回収し0.22 μmフィルター処理し充填
－
Lenti-X qRT-PCR Titration Kit（製品コード 631235）を用いたウイルスRNAタイター測定
－作業報告書作成
