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北海道システム・サイエンス / 北海道システム・サイエンス ID: J02182

次世代シーケンス　微生物群集解析 ID: J02182

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腸内細菌や環境中微生物の多様性を解析するコミュニティNGS

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サービスについて

概要

糞便、土壌などから抽出したゲノムDNAを対象として、16S rRNAなどのマーカー遺伝子のPCR増幅、ディープシーケンスを行い、サンプルに含まれる微生物の種類と占有率を明らかにします。

解析ワークフロー

  1. 土壌・糞便などからのゲノムDNA抽出
  2. 1st PCR（ターゲット領域の増幅、リンカー配列付加）
  3. 2nd PCR（アダプター配列付加）
  4. シーケンスデータ取得
  5. 標準データ解析（菌叢構成情報の算出、α多様性情報の算出）
  6. PCoAプロット作成 or 有意差検定（PERMANOVA） or 有意差検定（Differential Abundance Analysis）

解析対象領域（PCRプライマー）

北海道システム・サイエンス社では下記のプライマーをご提供しています。
その他の解析対象領域については、ご相談ください。

解析対象領域 プライマーの特徴 文献情報
Bacteria 16S rRNA V3-V4
（341F / 805R）		 北海道システム・サイエンス社で標準的に使用しているプライマーです。
真正細菌と、一部の古細菌を増幅します。		 Herlemann, Daniel PR, et al. The ISME journal 5.10 (2011): 1571-1579.
Bacteria 16S rRNA V3-V4
（341F’ / 805R）		 上記「341F / 805R」よりも古細菌の増幅効率が高いプライマーセットです。 Hugerth, Luisa W., et al. Applied and environmental microbiology 80.16 (2014): 5116-5123.
Bacteria 16S rRNA V3-V4
（335F / 769R）		 植物の葉緑体16S rRNAの増幅を抑え、細菌由来の16S rRNAを特異的に増幅します。植物が付着・混入したサンプルにお勧めです。 Dorn-In, Samart, et al. Journal of microbiological methods 113 (2015): 50-56.
Fungi ITS1
（ITS1-F_KYO1 / ITS2_KYO2）		 真菌に対応したプライマーセットです。 Toju, Hirokazu, et al. PloS one 7.7 (2012): e40863.

解析プラン

  • 乗り合い解析
    シーケンスデータ量：MiSeq 300bp ペアエンド 約10万リードペア/1検体
    MiSeq乗り合いシーケンススケジュールはこちら
  • 1RUNご購入
    シーケンスデータ量：MiSeq 300bp ペアエンド 約1,600万リードペア/1RUN（約30%はPhiXコントロール）

標準データ解析

  • 菌叢構成情報の算出
    サンプルに含まれる菌の種類と占有率を算出します。
    サンプルごと、群ごとの菌叢構成の傾向がわかります。（fig.1）
  • α多様性情報の算出
    希薄化曲線の形状や群集の多様度を表す指標値により、菌叢の多様性の高さと取得データの充足度がわかります。（fig.2）
  • PCoAプロット作成
    サンプル間の菌叢の類似度に基づき主座標分析を行います。PCoA プロットでは菌叢の似たサンプルが近くに集まり、群ごとのまとまりを視覚的に表すことができます。（fig.3）
  • 有意差検定（PERMANOVA）
    PERMANOVA では、サンプルを指定の群に分けた時に群間で菌叢に有意な差があるかを調べることができます。PCoAプロットとセットで利用されることが多い解析です。（fig.4）

fig.1 菌叢構成のグラフ

fig.2 α多様性情報

fig.3 PCoAプロット

fig.4 PERMANOVA 解析イメージ

オプションデータ解析

  • 有意差検定（Differential Abundance Analysis）
    群間における各菌の占有率の違いについて有意差検定を行います。p 値が低い菌は群間で占有率が有意に変動していると言えます。（fig.5）
  • 複数データセットの統合
    複数回実施された群集解析について、比較対象のサンプルのデータを統合して再解析（上記、標準データ解析）を行います。（fig.6）

fig.5 Differential Abundance Analysis 解析イメージ

fig.6 複数データセットの統合

サンプル必要量

糞便・土壌などをご提供いただき、DNA抽出からご依頼いただく場合
サンプル 必要量 保管・輸送温度
汚泥 5～10mL 冷蔵
土壌 1～5g 冷蔵
糞便 0.2～0.5g 冷凍
唾液 0.2～1mL 冷凍

＊ 検体を冷凍で保存されている場合は、冷凍でお送りください。
＊ 上記以外の試料につきましては、お問い合わせください。

ゲノムDNAをご提供いただき、1st PCRからご依頼いただく場合
サンプル 総量 濃度 液量
精製済みゲノムDNA 150ng以上 5ng/μL 以上 30μL以上

＊ サンプル量が上記基準に満たない場合でもご相談ください。

1st PCR産物をご提供いただき、2nd PCRからご依頼いただく場合
サンプル 総量 濃度 液量
精製済み1st PCR産物 ≧5ng ≧0.2ng/μL ≧20μL

＊ サンプル量が上記基準に満たない場合でもご相談ください。
＊ 北海道システム・サイエンス社より送付する1st PCR用プライマー、
　 あるいは北海道システム・サイエンス社指定リンカー配列付きのプライマーを使用してください。

2nd PCR産物をご提供いただき、シーケンスからご依頼いただく場合
サンプル 総量 濃度 液量
精製済み2nd PCR産物 ≧150ng ≧5ng/μL ≧20μL

＊ サンプル量が上記基準に満たない場合でもご相談ください。
＊ 基本的に乗り合い解析はご利用いただけません。MiSeq 1RUNをご利用ください。

ご注文に関して

以下のファイルをご利用の上、お問い合わせフォーム からご送付ください。

専用注文書類
次世代シーケンス_Illumina注文書（群集解析用） (Excel)

参考価格・納期

サービス項目 価格（税抜） 納期
次世代シーケンス
微生物群集解析		 乗り合い解析 DNA抽出 お客様にて実施 or ￥15,000/検体（＊1） お問い合わせ
1st PCR～精製 お客様にて実施 or ￥10,000/検体
2nd PCR～精製 ￥60,000/検体
MiSeqシーケンスデータ取得
データ解析
1RUNご購入 お問い合わせ お問い合わせ

＊1 DNA 抽出については、サンプルの種類・量・形状により価格が変わる場合がございます。

関連サイト

  • ※価格及び、サービスの仕様・内容などにつきまして、予告なしに変更されることがあります。
  • ※表示している参考価格は消費税等は含まれておりません。
  • ※受託サービスは、すべて研究目的として作業を行います。その他の目的（医療品・食品の製造・品質管理や医療診断など）には使用しないで下さい。
  • ※納期は参考納期です。諸事情により、前後する場合がございます。納期の詳細については個別にお問い合わせください。
  • ※会社名・サービス名などは、各社の商標・登録商標です。
  • ※納品物によっては、その構成物（例えば、ベクター、蛍光色素など）の使用に制限がある場合があります。
  • ※ヒト臨床サンプルの場合はインフォームドコンセントを得ていることをご確認ください。 ヒト由来のサンプルの場合、ご所属の組織の倫理委員会などで承認が得られたものが受領されます。
  • ※人間への感染性が疑われるサンプルに関しては、お受けできない可能性がございます。
  • ※サンプルの保管および返却を行っていない場合があります。お客様より提供いただいたサンプルおよび解析データ等は、業務終了後、廃棄される場合がございます。

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