RNA-Seq（トランスクリプトーム解析） ID: J00658

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mRNA、lincRNA、non-coding RNAなどの配列を網羅的にシーケンスし、発現解析をします。

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サービスについて

特長

専門のスタッフがイルミナ社シーケンサーを用いてSOPに準じて国内ラボで実験解析を行います。
衛生検査所の資格を有し、製薬企業をはじめ大学等の研究機関からのご依頼も多数あり、臨床研究の実績もあります。
1ng以下の微量サンプル、FFPE検体など、サンプルの性状に沿って実験計画から解析までサポートします。一度ご相談ください。

RNA-Seq（RNAシーケンス）とは
RNA-Seq（RNAシーケンス）は、次世代シーケンサーを用いてメッセンジャーRNA（mRNA）やlincRNA、non-coding RNAなどの配列情報を網羅的に読み取ります。その得られた配列情報から、どのRNAが発現しているか数値（発現値）に変換することで遺伝子発現を調べる解析手法です。

ストランド特異的に解析するので、ゲノムDNAの2本鎖のどちらからmRNAが生成されたのかを知ることが出来ます。すなわち、センス鎖、アンチセンス鎖を区別した解析が可能です。

マイクロアレイでは解析できない、エクソンレベルでの発現差解析、融合遺伝子の検出、mRNAからの変異解析など豊富な情報が得られます。

細胞や組織由来のRNAのほか、分解が進んだFFPE（ホルマリン固定パラフィン包埋）由来RNA、血清・血漿由来RNA、エクソソーム由来RNA、ソーティング細胞由来RNA、RIP-Assay後のRNAなど、様々なサンプルに対応しています。

概要

1	サンプルのクオリティチェックサンプルのクオリティチェック（QC）を行います。
2	シーケンスライブラリー調製サンプルの種類、分解度合い、解析の目的に応じたライブラリー調製キットを使用し、total RNAまたはmRNAからcDNA合成後、シーケンスアダプターを付加したシーケンスライブラリーを調製します。ライブラリー調製キット（Library Kit）は下記のものを取り扱っております。ご希望のキットがありましたらご相談ください。【前処理試薬】・QIAseq FastSelect –rRNA HMR Kit（QIAGEN社）・QIAseq FastSelect –Globin Kit（QIAGEN社）・QIAseq FastSelect –rRNA/Globin Kit（QIAGEN社）・NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module（NEB社）・NEBNext rRNA Depletion Kit（NEB社）・TruSeq Stranded total RNA Ribo-Zero H/M/R（illumina社）・TruSeq Stranded total RNA Ribo-Zero H/M/R Gold（illumina社）・TruSeq Stranded total RNA Ribo-Zero Globin（illumina社）【ライブラリー調製試薬】・NEBNext Ultra II Directional RNA Library prep for Illumina（NEB社）・SMART-Seq Stranded Kit（Clontech社）・TruSeq stranded mRNA（illumina社）
3	シーケンス調製したシーケンスライブラリーはQC後、illumina社の次世代シーケンサー（NextSeq 500, NovaSeq 6000, Hiseq Xなど）でシーケンスします。
4	データ解析シーケンス後のデータは、リファレンスゲノムにアライメント（マッピング）し、発現量を定量化（正規化）し、アノテーション情報を含むExcel形式のファイルで納品します。なお、デフォルトでは、TPMで定量化します。その後、 Fold Change（およびt検定）による発現変動遺伝子抽出、階層的クラスタリング、主成分分析（PCA）などを行います。ご希望に応じて、GO解析、パスウェイ（Pathway）解析、融合遺伝子の検出、スプライシングバリアントの検出、転写産物単位での発現差解析などの解析を実施します。

GO解析
抽出した遺伝子リストについてGO解析で特徴的なGO Termを抽出します。複数ある遺伝子の特徴を客観的につかむことが出来ます。
Pathway解析
Wikipathwaysに登録されたPathway上に、解析で得た遺伝子を発現情報（UP/DOWN）で色分けしPathway画像を作成します。さらに変動した遺伝子を有意に多く含むPathwayを絞り込むことができます。

統計解析（データ解析）

データ解析（fig.1）

fig.1 データ解析

リードの品質の評価を行います。生のリードデータから、アダプター配列やクオリティの悪い塩基をトリミング (除去)を行います。
リファレンスゲノムへのアライメント（マッピング）を行います。全リード数の集計、およびアライメント（マッピング）した全リード数、染色体別リード数を集計します。
サンプル間のリードカウントを補正するために正規化（TMM、TPM等）を行います。
階層的クラスタリングと主成分分析（PCA）を行います（6解析以上の場合）。
ご指定の比較に沿って、変動する遺伝子を抽出します。
発現変動遺伝子についてGO解析で特徴的なGO Termを抽出します。
得られた全遺伝子をPathway上にマッピングし、Pathway画像を作成します。発現変動遺伝子を有意に多く含むPathwayを絞り込むことが出来ます。
融合遺伝子の検出を行います。
新規スプライス部位の検出を行います。
エクソンレベル、スプライシングレベルの発現差解析などを行います。

納品物

original_fastq（FASTQ生データ）
trimmed_fastq（トリミング済みFASTQ）
bam（アライメントデータ）
サンプルQC結果
データQC結果（FastQC、MultiQC）
データ解析結果（正規化、変動遺伝子抽出、GO解析、Pathway解析）（fig.2）

＊ USBメモリ等の記憶媒体もしくはクラウド経由で納品します。

fig.2 データ解析結果例

サンプルについて

	RNA量	OD260/280	RIN値	送付液量	DV200
total RNA	100ng	1.5 以上	7 以上	10μL 以上	-
FFPE 由来 total RNA	500ng以上	-	-	10μL 以上	50以上
微量 total RNA	10pg ～10ng	-	-	10μL 以上	-
	細胞数	備考
微量細胞	1 ～ 500 cells	事前にサンプリングの方法についてお打ち合わせが必要です。必ず予めご相談ください。

ポイント
・有機溶媒が混入していない、カラム精製をしたtotal RNAをご送付ください。
・RNAは DNase 処理を行い、DNA のコンタミネーションがない状態のサンプルをご送付ください。
・total RNAはNuclease Free Waterに溶解してください。

注意
・国内ラボで実施の場合。提携企業先にサンプルを送付する場合はサンプル要件が異なり、より多くのRNA量を必要とします。別途お問い合わせください。
・サンプル量が上記に満たない場合はお気軽にご相談ください。
・組織、細胞、FFPEスライド等は、DNA/RNA抽出をご確認いただくか別途お問い合わせください。
・FFPE由来ではない分解サンプルは解析が難しい場合があります。
・送付方法はサンプル送付方法をご確認ください。

ご注文に関して

お問い合わせフォームよりお問い合わせください。

参考価格・納期

サービス項目	価格（税抜）	納期
RNA-Seq（トランスクリプトーム解析）	お問い合わせ	サンプルQC通過後、2ヶ月程度。（データ解析を含む場合は2.5ヶ月程度）

1	サンプルのクオリティチェックサンプルのクオリティチェック（QC）を行います。
2	シーケンスライブラリー調製サンプルの種類、分解度合い、解析の目的に応じたライブラリー調製キットを使用し、total RNAまたはmRNAからcDNA合成後、シーケンスアダプターを付加したシーケンスライブラリーを調製します。ライブラリー調製キット（Library Kit）は下記のものを取り扱っております。ご希望のキットがありましたらご相談ください。【前処理試薬】・QIAseq FastSelect –rRNA HMR Kit（QIAGEN社）・QIAseq FastSelect –Globin Kit（QIAGEN社）・QIAseq FastSelect –rRNA/Globin Kit（QIAGEN社）・NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module（NEB社）・NEBNext rRNA Depletion Kit（NEB社）・TruSeq Stranded total RNA Ribo-Zero H/M/R（illumina社）・TruSeq Stranded total RNA Ribo-Zero H/M/R Gold（illumina社）・TruSeq Stranded total RNA Ribo-Zero Globin（illumina社）【ライブラリー調製試薬】・NEBNext Ultra II Directional RNA Library prep for Illumina（NEB社）・SMART-Seq Stranded Kit（Clontech社）・TruSeq stranded mRNA（illumina社）
3	シーケンス調製したシーケンスライブラリーはQC後、illumina社の次世代シーケンサー（NextSeq 500, NovaSeq 6000, Hiseq Xなど）でシーケンスします。
4	データ解析シーケンス後のデータは、リファレンスゲノムにアライメント（マッピング）し、発現量を定量化（正規化）し、アノテーション情報を含むExcel形式のファイルで納品します。なお、デフォルトでは、TPMで定量化します。その後、 Fold Change（およびt検定）による発現変動遺伝子抽出、階層的クラスタリング、主成分分析（PCA）などを行います。ご希望に応じて、GO解析、パスウェイ（Pathway）解析、融合遺伝子の検出、スプライシングバリアントの検出、転写産物単位での発現差解析などの解析を実施します。

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